蛤弧菌探针法定量PCR荧光检测试剂盒

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

储存条件：

14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

探针法：
蛤弧菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒aqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’ 末端，而淬灭剂则在3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。相对于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性。
使用方法：
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意：DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线（以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DN段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头，从6号管中取5 μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头，从5号管中取5 μL溶液到4号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

应用案例：
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DN段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用
8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。设置 qPCR 反应（20  μL 体系，在样品制备室进行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在热销的产品：

NIPP1/ARD1  核抑制蛋白酸酶1抗体三糖铁(TSI)琼脂

NIPAL3  NIPA样蛋白3抗体培养基

NIPAL2  NIPAL2蛋白抗体三糖铁(TSI)琼脂斜面

NIPA  间变性淋巴瘤激酶核相互作用伴侣蛋白抗体赖氨酸脱羧酶试验培养基

Ninjurin 2  神经损伤诱导蛋白2抗体赖氨酸脱羧酶试验

Ninjurin 1  神经损伤诱导蛋白1抗体氨基酸脱羧酶试验对照

Ninein/GSK3B interacting protein  GSK3B相互作用蛋白抗体无菌液体石蜡

NIMP/RTN4IP1  NOGO相互作用线粒体蛋白1抗体ONPG 培养基

NIK/MAPKKK14  NFkB诱导激酶抗体营养琼脂（NA）

NIFK  KI67相互作用蛋白抗体营养琼脂平板（NA）

Nidogen 2  巢蛋白NID2抗体蛋白胨水（胰蛋白胨培养基）

Nicastrin  老年性痴呆蛋白APH2抗体培养基

NHLRC3  非霍奇金淋巴瘤重复蛋白3抗体Kovacs 靛基质试

NHLRC2  非霍奇金淋巴瘤重复蛋白2抗体缓冲葡萄糖蛋白胨水

NHLRC1  肌痉挛性癫痫病相关EPM2蛋白抗体V-P 试猪繁殖与呼吸综合征病通用型RT-PCR检测试盒白皮杉醇

蛤弧菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒猪繁殖与呼吸综合征病（Nsp2 1594~1680变异株）RT-PCR检测试盒白屈菜红

猪繁殖与呼吸综合征病通用型实时荧光RT-PCR检测试盒白屈菜

猪繁殖与呼吸综合征病（Nsp2 1594~1680变异株）实时荧光RT-PCR检测试盒白术内酯Ⅰ

高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）实时荧光RT-PCR检测试盒白术内酯Ⅱ

猪繁殖与呼吸综合征病美洲株实时荧光RT-PCR检测试盒白术内酯III

猪繁殖与呼吸综合征病欧洲株实时荧光RT-PCR检测试盒白头翁素

猪繁殖与呼吸综合征病美洲型经典株与高致病性变异株双重实时荧光RT-PCR检测试盒白头翁皂苷A

猪繁殖与呼吸综合征病欧洲株与美洲株双重实时荧光RT-PCR检测试盒白头翁皂苷B

猪繁殖与呼吸综合征（类NADC-30株） 实时荧光RT-PCR检测试盒白头翁皂苷B4