拟枝孢镰刀菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

储存条件：

14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

探针法：
拟枝孢镰刀菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒aqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’ 末端，而淬灭剂则在3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。相对于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性。
使用方法：
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意：DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线（以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DN段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头，从6号管中取5 μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头，从5号管中取5 μL溶液到4号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

应用案例：
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DN段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用
8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。设置 qPCR 反应（20  μL 体系，在样品制备室进行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在热销的产品：

4-二苯基化镁组织巨噬细胞型抗酒石酸酸性酸酶（STRACP）活性比色法定量检测试盒

2--3-氨基-5-吡啶破骨细胞型抗酒石酸酸性酸酶（STRACP）活性比色法定量检测试盒

烯酸异冰片酯睾丸型酸性酸酶（TACP）活性比色法定量检测试盒

4-基苯细胞果糖-1,6-二酸缩酶（ALD）定量检测试盒

2--3-氟异烟酸组织果糖-1,6-二酸缩酶（ALD）定量检测试盒

4-叔基苯磺酰胺血液果糖-1,6-二酸缩酶（ALD）定量检测试盒

1,7-庚二醇植物果糖-1,6-二酸缩酶（ALD）定量检测试盒

拟枝孢镰刀菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒2-硝基苯肼盐酸盐葡萄糖一6一酸脱酶（G6PD）定量检测试盒

肼基酸酯通用型谷氨酸酮酸转氨酶（GPT）活性光谱法定量检测试盒

2--5-羟基三氟苯细胞谷氨酸酮酸转氨酶（GPT）活性光谱法定量检测试盒

6-羟基-4-嘧啶酸组织谷氨酸酮酸转氨酶（GPT）活性光谱法定量检测试盒

3--5-硝基三氟苯血液谷氨酸酮酸转氨酶（GPT）活性光谱法定量检测试盒

1-(4-吡啶基)酮体液谷氨酸酮酸转氨酶（GPT）活性光谱法定量检测试盒

3-氟-4-氨基苯腈通用型谷氨酸草酰酸转氨酶（GOT）活性光谱法定量检测试盒

4--2-吡啶醇细胞谷氨酸草酰酸转氨酶（GOT）活性光谱法定量检测试盒酸钠Butyric Acid Sodium Salt室温干燥保存1g

基硫介质Butyl-S Medium常温保存50mL

基介质Buty Medium常温保存50mL

叠氮钠Sodium Azide常温保存25g

凋亡抑制蛋白Survivin基因PCR检测试盒低温运输，-20℃保存50T

凋亡抑制蛋白Livin基因PCR检测试盒低温运输，-20℃保存50T

凋亡DNAoutApoptotic DNAOUT-20℃保存24次

淀粉样 β- 蛋白片段 25-35Amyloid β-Protein Fragment 25-35-20℃保存250μg

电泳级酚蓝溶液Bromophenol Blue Solution，EG常温避光干燥保存10mL

电泳级尿素Urea，EG常温100g