犬细小病毒探针法荧光定量PCR检测试剂盒

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

储存条件：

14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

探针法：
犬细小病毒探针法荧光定量PCR检测试剂盒aqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’ 末端，而淬灭剂则在3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。相对于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性。
使用方法：
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意：DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线（以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DN段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头，从6号管中取5 μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头，从5号管中取5 μL溶液到4号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

应用案例：
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DN段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用
8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。设置 qPCR 反应（20  μL 体系，在样品制备室进行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在热销的产品：

8-羟基-1,2,3,4-四喹啉人肾小球组织糖基化终末产物(GTE-AGE)ELISA Kit，48T/96T

1-[2-氨基-1-(4-氧基苯基)基]环己醇盐酸盐人c-myc癌基因产物(c-myc)ELISA Kit，48T/96T

反式-4-(4-戊基环己基)苯腈人c-fos ELISA Kit，48T/96T

3-肉桂酸人c-jun ELISA Kit，48T/96T

2-氟-4-硝基苯腈人c-sis ELISA Kit，48T/96T

紫外线吸收 THUV-328人H-ras ELISA Kit，48T/96T

6-异基-9-基-1,4-二氧螺环[4,5]癸烷-2-醇人抗眼肌抗体(EMAb)ELISA Kit，48T/96T

孟布酮人抗肝特异性脂蛋白抗体(LSP)ELISA Kit，48T/96T

犬细小病毒探针法荧光定量PCR检测试剂盒4-基吡唑人细胞绒毛蛋白/埃兹蛋白(cytovillin/ezrin)ELISA Kit，48T/96T

邻苯酸酯人肾上腺素能a1A受体(ADRA1A)ELISA Kit，48T/96T

4-氰基-2-氟苯酸酯小鼠肾上腺素能a1A受体(ADRA1A)ELISA Kit，48T/96T

3,3'-二吲哚烷大鼠肾上腺素能a1A受体(ADRA1A)ELISA Kit，48T/96T

3-氰基吲哚人多巴胺D1受体(D1R)ELISA Kit，48T/96T

2-氨基-3,5-二氟吡啶小鼠多巴胺D1受体(D1R)ELISA Kit，48T/96T

1,9-二壬烷大鼠多巴胺D1受体(D1R)ELISA Kit，48T/96T C19orf21  19号染色体开放阅读框21抗体柚皮苷

C19orf18  19号染色体开放阅读框18抗体甘草次酸

C18orf56  18号染色体开放阅读框56抗体去氧胆酸

C18orf1  18号染色体开放阅读框1抗体香酚

C17orf97  17号染色体开放阅读框97抗体延胡索素

C17orf82  17号染色体开放阅读框82抗体辛弗林

C17orf78  17号染色体开放阅读框78抗体薄荷脑

C17orf77  17号染色体开放阅读框77抗体厚朴酚

C17orf75  17号染色体开放阅读框75抗体和厚朴酚

C17orf74  17号染色体开放阅读框74抗体甘草酸铵

C17orf66  17号染色体开放阅读框66抗体盐酸巴马汀

C17orf64  17号染色体开放阅读框64抗体盐酸药根碱

C17orf59  17号染色体开放阅读框59抗体酸枣仁皂苷A

C17orf57  17号染色体开放阅读框57抗体甘氨酸

C17orf53  17号染色体开放阅读框53抗体芍药苷