长双歧杆菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

储存条件：

14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

探针法：
长双歧杆菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒aqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’ 末端，而淬灭剂则在3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。相对于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性。
使用方法：
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意：DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线（以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DN段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头，从6号管中取5 μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头，从5号管中取5 μL溶液到4号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

应用案例：
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DN段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用
8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。设置 qPCR 反应（20  μL 体系，在样品制备室进行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在热销的产品：

那格列奈标准品人β血小板球蛋白/β血栓环蛋白(β-TG)ELISA Kit，48T/96T

那格列奈相关物质A标准品小鼠β血小板球蛋白/β血栓环蛋白(β-TG)ELISA Kit，48T/96T

那格列奈相关物质B标准品大鼠β血小板球蛋白/β血栓环蛋白(β-TG)ELISA Kit，48T/96T

那格列奈相关物质C标准品兔子β血小板球蛋白/β血栓环蛋白(β-TG)ELISA Kit，48T/96T

近红外系统适用性参考标准标准品人干扰素诱导蛋白10(IP-10/CXCL10)ELISA Kit，48T/96T

萘法唑酮盐酸盐标准品小鼠干扰素诱导蛋白10(IP-10/CXCL10)ELISA Kit，48T/96T

萘法唑酮相关物质A标准品大鼠干扰素诱导蛋白10(IP-10/CXCL10)ELISA Kit，48T/96T

长双歧杆菌探针法荧光定量PCR检测试剂盒萘法唑酮相关物质B标准品人凝溶胶蛋白(Gelsolin)ELISA Kit，48T/96T

磺酸奈非那韦标准品小鼠凝溶胶蛋白(Gelsolin)ELISA Kit，48T/96T

新橙皮甙二查尔酮标准品大鼠凝溶胶蛋白(Gelsolin)ELISA Kit，48T/96T

化新斯的明标准品人结蛋白(Des)ELISA Kit，48T/96T

纽甜标准品小鼠结蛋白(Des)ELISA Kit，48T/96T

纽甜相关物质A标准品大鼠结蛋白(Des)ELISA Kit，48T/96T

无水奈韦拉平标准品人心肌转录因子GATA4 ELISA Kit，48T/96T

半水奈韦拉平标准品小鼠心肌转录因子GATA4 ELISA Kit，48T/96T Cytokeratin 5/CK5  细胞角蛋白5抗体凝血酶（牛血）

Cytokeratin 3+12  细胞角蛋白3+12抗体纤维蛋白溶酶原（牛血）

Cytokeratin 13/CK-HMW  高分子量细胞角蛋白抗体纤维蛋白原（牛血）

Cytoglobin  细胞球蛋白抗体牛血红蛋白

Cytochrome P450 2D1  细胞色素CYP2D1抗体L-酪氨酸

Cytochrome P450 2B6  细胞色素P450 2B6抗体溶酶小球菌底物

Cytochrome c oxidase subunit 2  细胞色素c氧化酶亚型2抗体酸转酰化酶

Cytochrome C  细胞色素C抗体酰酸二锂盐

Cytochrome b5/CYB5A  细胞色素b5抗体胰蛋白酶

Cytochrome B/MT-CYB  细胞色素B抗体蛋白低分子量标准（SDS法）

Cystatin S  胱抑素S/半胱氨酸蛋白酶抑制S抗体血清白蛋白（牛）

Cystatin E/M  半胱氨酸蛋白酶抑制6抗体猪胰激肽释放酶

Cystatin D  胱抑素D/半胱氨酸蛋白酶抑制D抗体肠膜状明串珠菌

Cystatin C/CST3  胱抑素C/半胱氨酸蛋白酶抑制C抗体粪肠球菌

Cystatin B  胱抑素B/半胱氨酸蛋白酶抑制B抗体十八种氨基酸(套)