放线菌属通用探针法荧光定量PCR检测试剂盒

注意事项：1．基础程序；2．扩增温度和延伸温度；3．反应时间；4．循环次数；5．PCR 反应液的配制；6．PCR技术的基本原理；7．PCR的反应动力学；8．PCR扩增产物；9．PCR反应体系与反应条件。

储存条件：

14℃或－20℃样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000 转离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2. 血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000 转离心30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心10 分钟取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

探针法：
放线菌属通用探针法荧光定量PCR检测试剂盒aqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’ 末端，而淬灭剂则在3’ 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’ 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’ 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。相对于染料法,Taqman探针法具有更高的特异性和准确性。
使用方法：
一、样品DNA的制备
用自选方法提取细菌样品DNA。注意：DNA纯化方法是决定检测灵敏度的关键因素。如果不能很好纯化样品DNA，后面的PCR再灵敏也不能提高整体检测灵敏度。
二、制备O157:H7标准曲线（以10-10E6这6个10倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体病毒做阳性对照，只提供没有传染性的、可以直接使用的DN段作为阳性对照。
1. 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2和1号。
2. 用带芯枪头分别加入45 μL超纯水（用带芯枪头，下同）。
3. 先将本试剂盒提供的阳性对照用TE缓冲液或超纯水10倍梯度稀释到10E7拷贝/μL（注：请不要将本试剂盒提供的标准品一次性稀释至10E7拷贝/μL，建议每次稀释10倍，梯度稀释至10E7拷贝/μL）。
4. 在6号管中加入5 μL 10E7拷贝/μL的O157:H7阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得10E6拷贝/μL的阳性对照。
5. 换枪头，从6号管中取5 μL溶液到5号管中，充分震荡1分钟，得10E5拷贝/μL的阳性对照。
6. 换枪头，从5号管中取5 μL溶液到4号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。
7. NC管中不加任何阳性对照。
8. 从1-6号管中分别取5 μL和待测样品一起进行定量PCR（见下步），每个样品做3次重复。PCR后得到每个阳性对照稀释样品的荧光PCR Ct值，并以之为纵轴，以浓度的对数值为横轴，绘制标准曲线。
探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图：

应用案例：
样品 DNA 的制备
1.用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 DNA 提取试剂盒兼 容。。也可以选购本公司的一管式病毒 DNAout 或其升级版柱式病毒 DNAout。 本试剂盒免费赠送 15 次 DNA 病毒裂解液试用装（一管式病毒 DNAout 的成分）。
稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的长为 86bp 的 DN段作为阳性对照。
2.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
3.用带芯枪头分别加入 45 μL 模板稀释液（用带芯枪头，下同）。
4.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。5.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7.换枪头，在 4 号管中加 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用
8.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。设置 qPCR 反应（20  μL 体系，在样品制备室进行）
9.在 PCR 管中加入下列成分。
以下是公司正在热销的产品：

阿斯巴甜相关物质A标准品人基质金属蛋白酶3(MMP-3)ELISA Kit，48T/96T

阿斯巴甜安赛蜜标准品小鼠基质金属蛋白酶3(MMP-3)ELISA Kit，48T/96T

门冬氨酸标准品大鼠基质金属蛋白酶3(MMP-3)ELISA Kit，48T/96T

放线菌属通用探针法荧光定量PCR检测试剂盒阿司匹林标准品兔子基质金属蛋白酶3(MMP-3)ELISA Kit，48T/96T

阿司咪唑标准品人基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA Kit，48T/96T

阿替洛尔标准品小鼠基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐他汀钙标准品大鼠基质金属蛋白酶7(MMP-7)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐他汀相关物质A标准品人基质金属蛋白酶8/中性粒细胞胶原酶(MMP-8)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐他汀相关物质B标准品小鼠基质金属蛋白酶8/中性粒细胞胶原酶(MMP-8)

阿托伐他汀相关物质C标准品大鼠基质金属蛋白酶8/中性粒细胞胶原酶(MMP-8)

阿托伐他汀相关物质D标准品鸡5核苷酸酶(5-NT)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐他汀相关物质E标准品人5核苷酸酶(5-NT)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐他汀钙杂质H对照品标准品小鼠5核苷酸酶(5-NT)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐他汀钙杂质I对照品标准品大鼠5核苷酸酶(5-NT)ELISA Kit，48T/96T

阿托伐醌标准品人的神经生长因子(NGF)ELISA Kit，48T/96T GUSB/beta glucuronidase  β葡萄糖醛酸苷酶抗体辽东楤木皂苷V

GUK1/Guanylate kinase  鸟苷酸激酶GMK抗体辽东楤木皂苷X

GTSE1/G2 and S phase expressed 1  G2期/S期应答相关蛋白1抗体辽东楤木皂苷VII

GTSE-1  G2期/S期应答相关蛋白1抗体阿魏酸酯

GTPBP9  鸟嘌呤核苷酸结合蛋白9抗体茶碱

GTPBP4/CRFG  GTP结合蛋白4抗体（慢性肾功能衰竭蛋白）D(十)-无水葡萄糖

GTPBP10/Claudin12  紧密连接蛋白12抗体脱水穿心莲内酯

GTP cyclohydrolase 1/GTP-CH-1  三酸鸟苷环水解酶抗体槲皮素-7-O-葡萄糖苷

GTF2H1  通用转录因子2H肽1抗体香叶木素-7-O-葡萄糖苷

GTF2B  通用转录因子GTF2B抗体水仙苷

GTDC1  糖基转移酶样1抗体芍药内酯苷

GstP1/GST class-pi  谷胱甘肽硫转移酶pi基因抗体素

GSTO1  谷胱甘肽硫转移酶ω1抗体白蜡树素

GSTCD  谷胱甘肽硫转移酶C段结构域抗体环氧泽泻烯

GSTA3  谷胱甘肽S转移酶A3抗体N-基野靛碱