浅析荧光素酶检测试剂盒实验步骤

　　荧光素酶检测试剂盒是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，可以从细菌、萤火虫、海星等生物中提取出来。荧光素酶的这种催化底物产生自发荧光的特性可以灵敏地检测基因的表达。

 

　　可分别催化各自的底物发出不同颜色的荧光，且两种光吸收波长不同，检测互不干扰，因此可在同一个化学反应体系中同时使用，作为双荧光素酶报告基因系统使用，已成为研究转录因子参与基因调控的有效手段,通过对启动子DNA片段的分析,验证启动子结合元件的反式激活能力,探讨转录因子在信号转导中的分子机制。

 

　　荧光素酶检测试剂盒实验步骤：

　　（1）用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点（若目标是检测miRNA及其靶基因的靶向作用，则需要预测两者结合位点）。

　　（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（如pGL3-basic）中。

　　（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

　　（4）扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。

　　（5）培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时。

　　（6）将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

　　（7）质粒共转染48h后，弃去培养基，用100μl1XPBS洗1遍。

　　（8）倾斜96孔板，吸干剩余的PBS。

　　（9）去离子水将5XPLB稀释成1XPLB，使用前放到常温。

　　（10）每孔加50μl稀释好的1XPLB，摇床常温条件下摇15min，进行裂解。

　　（11）白色不透光的96孔酶标板中每孔加步骤（10）的上清液10μl，加入100μl预先混好的LARII，2s后测数据。

　　（12）每孔添加100μl预先混好的Stop&GloReagent，静止2s后，测数据。